實時熒光定量PCR儀使用的基本步驟

　　實時熒光定量PCR儀技術的原理：體外核酸擴增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸），Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復“變性→退火一引物延伸”過程至25-40個循環，呈指數級擴大待測樣本中的核酸拷貝數。簡單的說，PCR儀就是利用DNA聚合酶對特定基因做體外或試管內的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進行專一性的連鎖復制。目前常用的技術，可以將一段基因復制為原來的一百億至一千億倍。

　　實時熒光定量PCR儀使用的基本步驟：

　　①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃（左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

　　②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

　　③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。

　　實時熒光定量PCR儀重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，進入線性增長期或靜止期，即出現“停滯效應”，這種效應稱平臺期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的競爭等因素。大多數情況下，平臺期的到來是不可避免的。